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心脏成纤维细胞的体外培养特征探析[医学生物学]

添加时间:2016-05-23 17:08  所属栏目:医学论文 来源:解剖学报 作者:李辞霞 常玉巧 郭志坤
摘要

  心肌组织的主要细胞成分包括心肌细胞、成纤维细胞( cardiac fibroblasts,CFs) 、内皮细胞、平滑肌细胞、干细胞等。其中 CFs 约占心脏总细胞的60% ,其对心肌的内稳态平衡,细胞外基质重塑,心肌细胞之间交流,电生理活动等有重要的作用,在心脏受损后可迅速增殖,促使创伤愈合[1,2]。因此全面了解 CFs 分裂增殖的生物学行为,对于研究心肌再生具有重要意义。有关心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞的分裂增殖方式均有报道[3,4],然而,CFs的分裂特征如何,体外培养状态下细胞的分裂与组织水平的分裂方式是否相同等等,资料尚少。本实验利用体外分离培养的 CFs,在活细胞工作站下实时监测其生长状态、分裂方式,并通过免疫荧光技术标记不同分裂时相,为进一步研究其增殖机制提供形态学支持。

  材料和方法

  1. 实验动物

  出生 1 ~3d SD 大鼠共 40 只,雌雄不限,体重平均( 7. 5 ± 0. 46) g,由新乡医学院实验动物中心提供,动物合格证号: SCXK( 豫) 2010-0002。

  2. CFs 的分离培养和鉴定

  无菌条件下取新生大鼠心脏,立即放入 4℃ 无菌 PBS 液中,漂洗 3 ~4 次,去除与心脏相连的大血管和心房组织,用眼科剪将心室肌组织剪成约1mm3小块。加入 0. 125% Ⅰ型胶原酶( Sigma 公司) ,机械吹打 1min 后放入 37℃ 恒温水浴箱中消化 30min( 每 10min 取出吹打 30 ~40 次) ,吸取细胞悬液,加入等量的完全培养基( 含 12% 胎牛血清的低糖DMEM,美国 Hyclone 公司) 终止消化,1200r / min 离心 10min,弃上清,加完全培养基悬浮细胞并接种于24 孔板中。放于 37℃ 、5% CO2培养箱中培养 1h 差速贴壁,更换完全培养基,置于培养箱内继续培养。48h 后首次细胞换液,以后每 2 ~ 3d 更换完全培养基,同时在倒置显微镜和活细胞工作站下观察细胞生长情况。免疫荧光鉴定成纤维细胞波形蛋白的表达。选择 50 个视野,计数波形蛋白强阳性且有突起的细胞为 CFs。

  3. 活细胞工作站实时动态监测

  体外培养的原代 CFs 接种于激光共聚焦专用小培养皿中,直接放于活细胞工作站培养观察并截图摄片。接种 0 ~ 48h 期间,每 5min 摄片 1 张,48 ~96h 每 1min 摄片 1 张,96 ~ 168h 每 3min 摄片 1 张,同一视野连续实时监测 168h,上述方法重复 5 次。

  4. 间接法双重免疫荧光标记

  原代培养的 CFs 进行免疫荧光双标显色: 4%多聚甲醛溶液室温固定 30min,PBS 浸洗 3 次; 0. 3%Triton 透膜 10min,PBS 浸洗 3 次( 每次 3min) ; 正常山羊血清封闭,室温孵育 20min,吸弃山羊血清; 分为两组,第 1 组滴加 1∶ 200 小鼠抗大鼠波形蛋白单克隆抗体( 北京中杉金桥生物技术有限公司) 和兔抗大鼠磷酸化组蛋白 H3( phosphorylation of histone3,H3P) 单克隆抗体( Cell Signaling 公司,美国) ,第2 组滴加 1 ∶ 500 的兔抗大鼠波形蛋白单克隆抗体( Santa Cruz 公司) 和大鼠抗大鼠微管蛋白单克隆抗体( Abcam 公司) ,4℃ 孵育过夜; PBS 浸洗 3 次( 每次 3min) ,第 1 组滴加 1∶ 400 的 FITC 标记山羊抗小鼠和 Cy3 标记山羊抗兔二抗( 上海碧云天生物技术有限公司) ,第 2 组滴加 1∶ 400 的 FITC 标记山羊抗兔和 Cy3 标记山羊抗大鼠二抗( 上海碧云天生物技术有限公司) ,4℃ 孵育过夜; PBS 浸洗 3 次( 每次3min) ,10mg / L 4 ’,6-二脒基-2-苯基吲哚 ( 4 ’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI) 复染细胞核,荧光显微镜下观察摄像。空白对照为 PBS 代替免疫荧光一抗。

  结 果

  1. 原代培养 CFs 形态学观察

  原代培养 CFs 在悬液中细胞呈圆形,培养 0. 5 ~1h 后,可见细胞开始贴壁,呈梭形,胞体较小。培养2 ~ 3d 胞体大、胞核明显,有的细胞为双核乃至多核,细胞形态多样,呈三角形、梭形、扁平形、星形,且有少量突起。48 ~ 36h CFs 进入对数生长期,可见大量 CFs 隆起变圆进行分裂增殖。培养 3 ~4d CFs达到 90%汇合( 图 1A) ,免疫荧光检测波形蛋白表达为( 96. 3 ±1. 23) %( 图 1B) 。

  2. CFs 活细胞工作站实时动态监测

  活细胞工作站下观察,CFs 于培养 0. 5 ~ 1h 贴壁并伸出伪足生长,培养 2 ~3d 进入对数生长期,细胞大量增殖,可见处于间期的细胞呈扁平状贴于皿底并伸出伪足游走。有丝分裂前期细胞开始隆起变圆,胞质分裂后,细胞重新变为扁平状,细胞有丝分裂前期至胞质分裂约为 20 ~ 30min( 图 2A ~ 2H) 。

  少数 CFs 分裂期仍维持扁平状,扁平型分裂时程 40~ 50min。同时,观察到大量双核 CFs 存在,在活细胞工作站下对 50 个双核 CFs 进行了 24h 长时程的连续观察,未见到双核 CFs 继续完成胞质分裂,也未发现双核 CFs 再次分裂增殖。

  3、CFs 分裂方式的免疫荧光双标检测

  3. 1 圆隆型 CFs 有丝分裂免疫荧光双标观察: 有丝分裂前期细胞核形状规则,较间期核大、荧光强度高( 图 3A1) ,H3P 开始表达( 图 3A2) ; 分裂前中期核膜解体染色质缩短变粗形成染色体( 图 3B1) ,H3P 荧光信号增强,主要分布在染色体的末端( 图3B2) ; 分裂中期染色体排列在赤道板处( 图 3C1) ,H3P 的红色荧光信号在染色体上表达达到高峰( 图3C2) ; 分裂后期,凝集的染色体开始移向细胞两极( 图 3D1) ,H3P 红色荧光信号遍布整条染色体并随染色单体分裂而分开( 图 3D2) ; 分裂末期染色体到达两极,子核形成( 图 3E1) ,H3P 的红色荧光信号逐渐减弱( 图 3E2) ; 胞质分裂期 H3P 的红色荧光信号逐渐消失( 图 3F2) ,形成两个子细胞( 图 3F3) 。

  4、分裂的细胞隆起变圆( 图 3)

  CFs 进入有丝分裂间期,细胞微管蛋白网络结构解聚,再重组装形成纺锤体微管( 图 4A2,4B2,4C2,4D2) ,分裂末期,纺锤体微管解聚,又重组装形成胞质微管网络( 图 4E2,4F2) 。有丝分裂前期,染色质浓缩,DAPI 荧光信号增强( 图 4A1) ,微管蛋白仍分布于整个胞质( 图 4A2) ; 有丝分裂前中期核膜解体染色质缩短变粗形成染色体( 图 4B1) ,纺锤体微管形成,荧光信号强,胞质微管网络荧光消失( 图4B2,4B3) ; 有丝分裂中期染色体排列在赤道板上( 图4C1) ,纺锤体呈典型纺锤样( 图4C2) ; 有丝分裂后期染色单体分开并移向两极( 图 4D1) ,纺锤体拉长( 图 4D2) ; 有丝分裂末期子核形成( 图 4E1) ,许多平行微管聚集在两子核之间,胞质微管荧光重新出现( 图 4E2) ; 胞质分裂形成两个子细胞( 图 4F1) ,子细胞分开后,可见有少量微管藕断丝连( 图 4F2) ,波形蛋白荧光已完全分开( 图 4F3) 。处于分裂期的CFs 隆起变圆( 图 4) 。

  扁平型 CFs 有丝分裂的免疫荧光双标观察: 体外培养的 CFs 在有丝分裂期有极少数细胞未隆起变圆而仍维持扁平状。处于分裂中期 CFs 染色体排列在赤道板( 图 5A) ,微管呈典型纺锤样( 图 5B) ,胞体大而扁平( 图5C) ,将同一视野的图片叠加可以看到处于分裂中期的 CFs 未隆起变圆而仍维持扁平状( 图 5D) ,这也是一种有丝分裂过程。

  CFs 无丝分裂的免疫荧光双标观察: 偶可观察到少数 CFs 细胞核的中部向内凹进缢裂成为两个细胞核,核内无染色体的变化( 图 6A) ,无典型纺锤体( 图 6B) ,整个细胞从中部缢裂成两部分,形成两个子细胞( 图 6C) ,将同一视野的图片叠加可以看到CFs 无丝分裂方式( 图 6D) 。这些细胞分裂的另一特征是细胞核形似水滴,向两侧移动,中间存在长长的核丝相连( 图 6) 。与有丝分裂相比,无丝分裂的数量较少。

  讨 论

  心肌组织的细胞成分主要有成纤维细胞、心肌细胞、内皮细胞、干细胞、平滑肌细胞、Telo 细胞、神经节细胞、脂肪细胞等,这些细胞在不同的环境下几乎都具有分裂增殖能力。有关 CFs 和心肌细胞的分裂研究以往大多局限在组织学水平,在体外培养状态下进行单细胞的分裂观察相对较少。目前尚鲜见到在体外培养状态下有关 CFs 的分裂方式和分裂过程的研究。随着特异性抗体的出现和活细胞工作站的应用,使得研究细胞分裂时程成为可能。我们在先前对心肌细胞分裂方式研究的基础上[3,4],动态观察 CFs 的分裂方式。在细胞水平研究 CFs 的分裂过程,纯化 CFs 和特异性标记是其关键。本实验经成纤维细胞的特异性标记———波形蛋白标记并对其定量分析显示,CFs 的纯度在( 96. 3 ±1. 23) %,证明了实验的 CFs 几乎不受其他细胞干扰,观察到的分裂增殖细胞( CFs) 结果可靠。

  CFs 在心脏发育和重塑中起着重要作用。在心肌损伤早期,CFs 的激活、增殖对维持心脏结构和功能起着至关重要的作用,而 CFs 过度增生则导致瘢痕形成和不良心室重构[5]。小鼠心肌梗死后成纤维细胞可以转化为心肌样细胞,促进损伤修复[6]。心肌梗死后形成的瘢痕组织中,成肌纤维细胞的出现及其表达都与体外培养的类似,因此,体外培养新生和成体 CFs 转化为肌成纤维细胞均与体内的肌成纤维细胞表达一致[7]。表明 CFs 在体内外均表现出活跃的分化和增殖功能。

  体外培养的 CFs 会很快进入细胞周期,分裂增殖能力强,可多次传代。但随着培养时间的延长和传代次数的增加,CFs 活性降低,增殖减慢,细胞衰老、凋亡或出现细胞分化[8]。本实验采用原代培养1 ~ 3d 的新生大鼠 CFs,生长状态好,分裂增殖能力强,可观察到处于不同分裂期的细胞及染色体的变化。通过活细胞工作站实时动态观察发现,CFs 在有丝分裂过程中有两种类型: 圆隆型和扁平型,圆隆型的细胞先呈扁平状贴于皿底,进入有丝分裂前期细胞开始隆起变圆,胞质分裂后,细胞重新变为扁平状,多数 CFs 都是这种分裂方式。圆隆型细胞从有丝分裂前期至细胞质分裂整个时程为 20 ~ 30min。

  扁平型 CFs 分裂时并不隆起变圆,而是仍维持原有的扁平状,这种细胞的比例较少。扁平型细胞从有丝分裂中期可观察到染色体变化到完成胞质分裂需40 ~ 50min,较圆隆型的分裂时程明显延长,因此,体外培养状态下,隆起变圆分裂的 CFs 可能更有利于其有丝分裂的完成。微管蛋白作为细胞的骨架蛋白存在于多数细胞内,在有丝分裂期的变化非常大。有丝分裂过程中一旦所有的染色体都与纺锤体微管正确结合后,动点上的微管解聚与马达分子一起发挥作用,牵拉着染色体向两极运动,同时纺锤体两极也向子细胞运动,使得每个子细胞得到相等数量的染色体[9],从而完成有丝分裂。为了进一步观察 CFs 分裂过程及分裂期微管蛋白的变化,分别标记仅在有丝分裂期出现的 H3P 抗体以及在有丝分裂期能够形成纺锤体的微管蛋白抗体。通过免疫荧光双标,再次验证了 CFs 的有丝分裂存在圆隆型和扁平型两种有丝分裂形式,且圆隆型是主要的有丝分裂形式。间期CFs 微管蛋白网络遍布整个细胞质,进入有丝分裂前中期,微管网络结构解聚,重组装形成纺锤体,无论是隆起变圆还是非隆起变圆的 CFs 的微管蛋白荧光信号几乎全部位于纺锤体上,而胞质其他部位的微管蛋白荧光信号消失,分裂末期微管蛋白则又遍布整个胞质。

  免疫荧光波形蛋白和微管蛋白双标后,发现极少数 CFs 细胞核的中部向内凹陷,缢裂成为两个细胞核,同时胞质分裂形成两个细胞,而无染色体、纺锤体的变化,细胞核在分裂移动时,在两核之间呈现为细长的核丝,这种现象可能是 CFs 的无丝分裂方式,遗憾的是,活细胞工作站并没有捕捉到实时动态的无丝分裂过程,因此,CFs 的无丝分裂证据尚需进一步研究。无丝分裂现象主要存在于植物细胞和低等动物,哺乳动物的少数器官也存在少量无丝分裂细胞。近年来在高等动物中也发现了无丝分裂的增殖方式[10,11],如干细胞、内皮细胞、肿瘤细胞[12]、心脏心内膜下细胞[13]、心脏肥大心肌细胞[14]等。最近,我们发现,大鼠心肌细胞[3]、成纤维细胞、心 Telo细胞[15]和心干细胞中均发现了无丝分裂象。可见在哺乳动物体内无丝分裂方式是普遍存在的,只不过数量较少,光学显微镜下不易被察觉。无丝分裂是一种简单、耗能少的分裂方式,在器官分化、发育和重构中起何作用还有待进一步探讨。体外培养的CFs 存在大量双核细胞,有人认为双核细胞是无丝分裂的核分裂阶段,可继续进行细胞质分裂,也可再进入有丝分裂[16],但高等动物是否存在无丝分裂一直有争议。本研究在活细胞工作站下对双核 CFs 进行了长时程的大量观察,未见到双核 CFs 继续完成胞质分裂,也未发现双核 CFs 再次分裂增殖。总之,本实验系统地研究了 CFs 的体外分裂方式和分裂过程。CFs 在有丝分裂时表现为圆隆型和扁平型两种形态,在分裂方式上存在有丝分裂和无丝分裂,不同的分裂方式在功能上可能存在互补。

  本实验结果为进一步研究 CFs 的增殖机制、心肌组织工程的种子细胞、心肌损伤治疗等提供了细胞学基础和理论依据。

  参 考 文 献
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