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鸡源棒状杆菌的分离鉴定及同源性分析

添加时间:2017-08-14 09:10  所属栏目:职称论文 来源:未知 作者:admin
  摘要:笔者对发生传染性眼炎的病鸡送检病料进行了病原分离鉴定,为该病的实验室诊断提供参考资料。用接种环蘸取病鸡的眼结膜,在兔血琼脂平板和含 5%小牛血清 TSA琼脂平板上进行病原的分离培养、形态观察、生化试验、16SrRNAPCR扩增、序列测定、同源性分析。结果从病鸡的眼结膜上分离到一株革兰氏阳性杆菌。该菌对营养要求高,在营养琼脂平板和 LB琼脂平板上呈贫瘠的露滴状菌落,在兔血琼脂平板和含 5%小牛血清的 TSA琼脂平板上生长良好,呈不溶血圆形隆起、白色半透明、光滑湿润的露滴状菌落。该菌与棒状杆菌 HM215052.1同源性达 99.3%.说明该群鸡是由棒状杆菌所引起的传染性眼炎。
  
  关键词:鸡;传染性眼炎;革兰阳性杆菌;同源性分析;棒状杆菌。
  
  近些年来,随着畜禽养殖业的集约化发展,畜禽的各种传染病的发病率日趋增多,如革兰阳性杆菌引起的细菌性传染病,对人类和畜禽常造成较大影响,常给养殖业带来较大的经济损失[1].常见的革兰阳性致病杆菌有产气荚膜梭菌、炭疽杆菌、红斑丹毒丝菌、棒状杆菌、单核细胞增生性李斯特菌及肉毒梭菌等。其中,棒状杆菌在自然界分布较广,可引起多种动物和人的传染病[2].棒状杆菌属包括 88种棒状杆菌,其中 53种可以使人感染或者通过动物感染人,其余的种广泛存在于自然界中[3].棒状杆菌常呈隐性感染,但对动物有致病性的主要有化脓棒状杆菌、肾棒状杆菌、假结核棒状杆菌、马棒状杆菌和猪棒状杆菌。棒状杆菌常以某些组织和器官发生化脓性或干酪样病理变化为特征[4-5].
  
  笔者从安徽蚌埠某蛋鸡场送检的病鸡眼结膜表面分离出一株细菌,进行培养特性观察、形态观察、生化试验、16SrRNA的 PCR扩增、序列测定、同源性分析,为该病的试验室诊断提供参考资料。
  
  1 材料与方法。
  
  1.1 材料。
  
  安徽蚌埠某蛋鸡场送检的发生传染性眼炎的病鸡若干只。
  
  1.2 方法。
  
  1.2.1 病原菌的分离培养。
  
  用无菌接种环蘸病鸡眼结膜,分别划线接种于兔血琼脂平板和含 5%小牛血清 TSA琼脂平板,在5%CO2培养箱中 37℃培养 18h~24h.
  
  1.2.1.1 分离菌革兰染色、镜检。
  
  将分离菌抹片、革兰染色后,在油镜下观察。
  
  1.2.1.2 分离细菌的培养特性观察。
  
  挑取在含 5%小牛血清 TSA琼脂上生长的单个菌落,分别接种于营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板和LB琼脂平板,置于 5%CO2培养箱中 37℃培养 18h~24h.
  
  1.2.2 分离菌的生化试验。
  
  对分离菌进行了糖类分解试验、吲哚形成试验、甲基红(MR)试验和 VP试验。
  
  1.2.3 鸡只同居饲养试验。
  
  将 2只发病鸡放入 4只 3月龄健康产蛋鸡的笼中,每天观察鸡的健康状况。
  
  1.2.4 分离菌的 PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳。
  
  1.2.4.1 分离菌 DNA模板的制备。
  
  将在 5%小牛血清 TSA琼脂平板上培养 18h~24h长出分离菌的菌落用50uLL超纯水洗下,煮沸10min,冰浴 5min,12000r/min离心 5min,上清液即为 DNA模板,-20℃保存备用。
  
  1.2.4.2 引物设计与合成。
  
  选用细菌通用引物,由通用生物系统(安徽)有限公司合成[6].即上游引物 F:5'-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3';下游引物 R:5'-ACGGCTACCTTGTTACGAC-TT-3'.
  
  1.2.4.3 PCR扩增。
  
  反应体系:
  
  Taa缓冲液(Mg2+)5uL、模板 DNA5uLL、dNTPS(25mmoL/%L)4.0uLL、上下游引物各 1.0uLL、Taa聚合酶(5u/uL)0.25uLL,用超纯水补充至 50uLL.
  
  扩增条件:95℃预变性 5%min;95℃变性 30%s;60℃退火 30%s,72℃延伸 2%min,30个循环;72℃延伸 5%min.
  
  1.2.4.4 琼脂糖凝胶电泳。
  
  将 PCR产物使用 1.0%琼脂糖凝胶电泳,电压110V,电泳 30min,在凝胶成像系统中观察并拍照。
  
  1.2.5 序列测定。
  
  将扩增的 PCR产物送往通用生物系统(安徽)有限公司测序。
  
  2 结果。
  
  2.1 分离菌在各种培养基上的生长表现及革兰染色镜检结果。
  
  从发病鸡的眼结膜上分离到 1株细菌,命名为FY2015.该菌对营养要求高,在 5%CO2培养箱 37℃环境中培养 18h~24h后,营养琼脂平板和 LB琼脂平板生长贫瘠,呈圆形隆起、白色半透明露滴状菌落;在鲜血琼脂和含 5%小牛血清 TSA琼脂平板上为呈圆形隆起、白色半透明、光滑、湿润不溶血露滴状菌落;在麦康凯琼脂上不生长。该菌为革兰阳性短杆状或球杆状,排列不规则。
  
  2.2 分离菌生化试验结果。
  
  该分离菌不能利用葡萄糖、麦芽糖和乳糖;甲基红、吲哚形成和 VP试验均为阴性。
  
  2.3 鸡只同居饲养试验结果。
  
  将发病鸡放入健康鸡的笼中同居饲养,第 2天上午,4只健康鸡陆续出现肿脸、流泪等传染性眼炎症状,当天晚上鸡只全部发病,并且从被感染鸡的眼结膜上又分离到上述细菌。
  
  2.4 PCR扩增及琼脂糖电泳结果。
  
  将 PCR扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像系统中观察,扩增出约有 1500bp与预期大小相一致的片段(见图 1)。
  
  2.5 分离菌同源性分析。
  
  用 DNAStar软件将该分离菌 FY2015(在 GenBank中的登录号为 KT824798.1)的 16SrRNA的序列测定结果与 GenBank中 11株棒状杆菌属参考菌株进行同源性对比并构建遗传进化树(见图 2和图 3)。
  
  FY2015为分离菌,其它 10株为棒状杆菌属的参考菌株。根据图 3结果判定,该分离菌与棒状杆菌HM215052.1同源性达 99.3%,说明该分离菌 FY2015为棒状杆菌。
  
  3 讨论。
  
  鉴定细菌的经典方法是细菌分离培养、生化试验,需时较长,且准确性不高。目前细菌的鉴定已经普遍使用分子生物学的方法[7].16SrRNA基因序列的不同反映了不同细菌的亲缘关系,高度保守性是其 DNA序列的特性,但在保守区之间存在几个可变区,可变区在不同的科、属、种之间存在一定的变异,可通过比较不同细菌基因序列间的差异,对分离菌进行分类鉴定[8].Bosshard等认为,16SrRNA基因序列相似率大于 99%可鉴定为同一个种,相似率 95%~99%可鉴定为同一属[9].笔者对分离菌 16SrRNA序列的同源分析结果显示,该株分离菌与棒状杆菌HM215052.1同源性达 99.3%;因此,可确定该分离菌 FY2015为棒状杆菌。
  
  棒状杆菌常存在于人或动物鼻腔、咽喉、外耳道、眼结膜、外阴中及皮肤的表面,多数对人类和动物不致病,只有少数具有致病性,有些属于条件致病菌,可引起人和动物的各种急性和慢性传染病[10-11].动物同居试验显示,该棒状杆菌具有较强的传染性,与发病鸡密切接触的健康鸡很快被感染发病;因此,该株分离菌的传染性和致病性均较强。
  
  参考文献:
  
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  [3] 秦毅斌,何苹萍,卢冰霞,等。猪源棒状杆菌的分离及其 16SrRNA基因分析[J].畜牧与兽医。2016,48(3):95-99.
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  [7] 马章林,唐曙明,楼许柏。16SrRNA在医学微生物鉴定中的应用探讨[J].吉林医学,2011,32(12):2291-2292.
  [8] 沈亚娟,夏云。16SrRNA基因序列分析鉴定非典型细菌的实验研究[J].重庆医学,2013,42(1):46-48.
  [9] Bosshard PP,Abels S,Zbinden R, et a1.Ribosotnal I>NAS'equencing for identification of
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  [10]肖林晋,孙延鸣。犊牛棒状杆菌的分离鉴定[J].畜牧与兽医,2012,44(9):79-81.
  [11]高正琴,张强,邢进,等。鼠棒状杆菌的分离与鉴定[J].实验动物科学,2008,25(1):18-20.
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